在细胞生物学中，基因过表达和敲除/敲降技术通常成对用于研究选定的基因。在肠道微生物群研究中，细菌植入和悉生动物模型常用于研究感兴趣的细菌。然而还没有敲除/敲低细菌的标准方案可用于肠道微生物群研究。
近期，缮菌生物创始人朱峰教授与多位科研人员合作在Cell子刊《Cell Reports Methods》上发表论文。该研究创新性地提出了噬菌体定向敲除肠道细菌动物模型（Targeted-Bacterium-Depleted mouse model, TBD），充分验证了TBD模型可以靶向敲除目标肠道微生物群，接受噬菌体处理的动物表现出除目标细菌敲除外几乎完整的肠道细菌谱。这一发现为研究肠-脑轴动物模型的建立提供了一个全新的方法，并有望成为研究肠道微生物群相关疾病的有力工具。
缮菌CRO
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Cell Reports Methods简介
Cell Reports Methods是Cell Press在2021年推出的一本开放获取多学科期刊，是CNS子刊中除Nature Methods外唯一的方法学专刊，更侧重于可重复的稳健方法。关注的领域包括测序和成像技术、基因组编辑、单分子方法、计算方法、生物技术和合成生物学等方面的创新方法。
摘要
肠道微生物组对人类健康至关重要。小鼠微生物群模型，包括悉生小鼠，是阐明肠道细菌功能的最有用工具。这篇文章提出了一种靶向细菌敲除（TBD）模型，使用裂解噬菌体选择性地敲除健康或其他模型小鼠的肠道细菌。这些噬菌体处理的动物除了敲除的细菌，应该具有几乎完整的肠道细菌谱。为了证明这一概念，研究者采用大肠杆菌特异性噬菌体T7来抑制健康小鼠中的大肠杆菌。实验结果表明，敲除大肠杆菌的小鼠表现出勇敢的行为，这与大肠杆菌的存在而非肠道细菌之间的平衡有关。因此，研究者证明TBD模型是一种可用于阐明近乎完整肠道微生物群环境中特定细菌物种功能的有力工具。
研究背景
肠道是人体中最大的微生物群库，存在着一系列细菌、真核生物和病毒。肠道细菌的多样性和相互作用极大地影响宿主的新陈代谢，与人类健康的诸多方面息息相关。例如，肠道微生物群可以调控宿主免疫反应，微生物群组成的改变能够影响一系列疾病的发生发展。此外，药物作用通常会对肠道微生物群产生影响。药物-细菌相互作用对用于治疗精神分裂症等精神疾病的疗法产生了深远影响。
微生物群-肠-脑轴（MGB）是微生物群-宿主相互作用的典型例子。MGB从肠-脑轴（GBA）扩展而来，GBA描述了大脑和肠道神经系统之间的双向通信，MGA则描述了肠道微生物群与中枢神经系统之间的关系。例如，肠道微生物可以产生神经活性分子，通过迷走神经在肠道神经系统和大脑之间传递信号。在胁迫条件下，微生物群的组成也可以通过肠上皮细胞，经由下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴通过进行调节。某些肠道细菌的丰度与心理健康状况相关，称为心理生物组（psychobiome）。例如，肠道中的前庭链球菌（Streptococcus vestibularis）可以诱导精神分裂症样行为，抑郁症患者的粪球菌属（Coprococcus）和小杆菌属（Dialister）水平通常降低。
大肠杆菌占肠道微生物群的0.1%-5%，是用于研究MGB的一种特征明确的模式生物。虽然它产生对哺乳动物宿主功能至关重要的维生素K和B12，但它也可能诱发患者的精神症状。此外，具有诱导焦虑样行为的小鼠肠道大肠杆菌水平升高。研究者目前对MGB的大部分理解都是使用经过抗菌处理的人造动物模型确定的，包括无菌小鼠和无特定病原体（SPF）小鼠。这些动物模型有其自身优势：抗生素处理的小鼠模型易于研究，但无法评估单个细菌菌株的影响。虽然使用接种了选定微生物无菌小鼠构建的悉生小鼠模型是研究特定菌株的金标准，但其生理影响在自然环境中可能不具有代表性。此外，使用悉生生物模型的研究既耗时又昂贵。
本文中，研究者提出了一种新的动物模型，该模型结合了悉生小鼠模型在细菌菌株精度方面的优点，以及仅使用普通小鼠即可建立的便利性。通过使用裂解噬菌体，可以在动物模型中靶向敲除特定的肠道细菌。为了证明这一假设的可行性，研究者选用大肠杆菌特异性噬菌体T7去除健康小鼠肠道中的大肠杆菌，并通过分子和表型分析来检测其影响(图1)。令人惊讶的是，这些靶向敲除大肠杆菌（TBD）小鼠表现出类似于先前发表的抗焦虑和抗抑郁治疗效果的行为变化。与对照组相比，这些原本健康的动物获得了“勇敢”的行为特征，但不过度活跃。因此，本研究表明TBD小鼠模型提供了一种与传统悉生模型互补的方法来验证实验数据，并且可以通过选择不同噬菌体来研究各种肠道细菌。
图1. 靶向细菌敲除（TBD）模型与悉生小鼠模型的比较。TBD模型使用裂解噬菌体来抑制靶向细菌的水平，为悉生小鼠模型提供了一种补充方法。
研究方法
本研究使用健康的6周龄雌性C57BL/6J小鼠，用大肠杆菌噬菌体T7与大肠杆菌（菌株K12）进行处理。在噬菌体处理后第0、1、2、4、6、8、10、12和14天收集粪便样品，对小鼠肠道细菌的绝对丰度和多样性进行分析。本研究行为测试包括：旷场实验、互惠社交互动测试、三箱社交测试、高架十字迷宫试验、新物体识别测试、新颖性抑制饲养试验和悬尾实验。行为实验后，每组随机取3只小鼠，对肠道等器官进行组织学分析。
研究结果
1. T7噬菌体给药对小鼠身体状况无明显影响
为了验证研究者的模型，使用靶向大多数大肠杆菌菌株的T7噬菌体。本实验通过小鼠胃内给药处理方式，分别设置了106 PFU/mL T7（T7L）、1011 PFU/mL T7（T7H）、1011 PFU/mL 失活T7（高压灭菌处理）（dT7H）和水处理共4个平行组，测量各种生命体征，收集粪便样本，并定期进行一系列行为测试（图2A）。正如预期的那样，T7噬菌体处理对小鼠的身体状况没有明显影响（图2B)
图2. T7噬菌体抑制大肠杆菌水平但不影响身体状况和肠道细菌的总量。（A）本研究中使用的时间框架和行为测试的示意图（每组n = 12）。OFT，旷场实验；RSIT，互惠社交互动测试；TCST，三箱社交测试；EPM，高架十字迷宫试验；NOR，新物体识别测试；NSF，新颖性抑制饲养试验；TST，悬尾实验。（B）身体状况：在不同时间测量的体重（左），每日饮水量（中）和每日食物摄入量（右）（每组n = 12）。
2. T7噬菌体选择性敲除大肠杆菌但不影响肠道细菌总量
研究者使用qPCR来量化大肠杆菌和肠道细菌的总量，以跟踪噬菌体给药后的动态变化。在14天的过程中，所有组中的肠道细菌总数没有表现出明显的变化。然而，与对照组相比，T7H组的大肠杆菌迅速降低至∼10%，并在第14天逐渐恢复至∼25%，可能是由于其对噬菌体的获得性抗性。此外，T7L组中大肠杆菌的下降在第6天后开始，并在第8天时达到与T7H组相同水平（图2C）。
图2. T7噬菌体抑制大肠杆菌水平但不影响身体状况和肠道细菌的总量。（C）通过qPCR随时间定量的大肠杆菌水平（左）和总细菌水平（右）随时间变化（每组n = 12）。
3. 大肠杆菌的敲除导致肠道微生物群中物种代表性减少
为了研究大肠杆菌减少的级联效应，研究者通过对16S rRNA基因扩增子（V3-V4区）进行测序来量化微生物分类单元的绝对丰度，以评估肠道微生物群的动态变化。实验在4个时间点（即0天和T7噬菌体处理后4、8和14天）研究了粪便微生物群组成。结果发现Chao1指数存在显著差异，但T7噬菌体对香农指数和辛普森多样性指数没有显著影响。相对于对照小鼠，大肠杆菌敲除小鼠的肠道中细菌丰富度降低（图3）。时间和T7噬菌体对微生物组成的β多样性均有显著影响（图3D）。随着T7噬菌体处理，敲除大肠杆菌小鼠肠道微生物群β多样性逐渐降低，其β多样性在第8天升高，但在第14天下降。在噬菌体灌胃后第4天和第14天，大肠杆菌敲除小鼠中25和31个肠道细菌属的绝对丰度与对照小鼠存在差异。此外，24个肠道细菌属的丰度表现出明显的纵向变化，而两组之间微生物群的纵向改变模式不同（图3E）。
图3.大肠杆菌敲除引起肠道微生物群的动态变化。（A-C）肠道微生物群α多样性指数（香农、辛普森和Chao1）。（D）基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）。（E）受T7噬菌体调控并随时间显著变化的24个细菌属的丰度变化热图：左为对照组，右为T7组。
4. 大肠杆菌敲除的小鼠表现出行为异常
为了探讨肠道大肠杆菌对宿主的影响，研究者进行了7项行为测试，涵盖精神状态和社交能力，其中五项测试显示T7H组与对照组相比有显著差异。在旷场实验（OFT）中，虽然每组的总距离没有差异（表明各组之间的基础运动活性相似），但T7H小组在明亮的旷场花费了更多时间，并表现出类似于服用抗焦虑药的行为模式（图4A）。
图4. 大肠杆菌敲除小鼠表现出抗焦虑药治疗的行为模式。（A）旷场实验。
在高架十字迷宫（EPM）实验中，T7H组小鼠更频繁地进入开放臂，并持续更长时间，这与先前报道的抗焦虑小鼠模式相似（图4B）。在新奇抑制摄食（NSF）实验中，由于NSF对急性抗焦虑药和慢性抗抑郁药治疗敏感，但对急性抗抑郁药不敏感，因此两个T7处理的动物组都表现出类似于之前描述的服用抗焦虑药的行为（图4C）。在悬尾实验（TST）中，T7H和T7L组小鼠的不动时间明显短于对照组（图4D）。
图4. 大肠杆菌敲除小鼠表现出抗焦虑药治疗的行为模式。（B）高架十字迷宫试验。（C）新颖性抑制饲养测试。（D）悬尾实验。
TST通常用于评估抗抑郁活性，这一实验证明噬菌体T7可有效抗抑郁，但不能证明其抗焦虑。相比之下，这些群体的一般社交能力和对社会新奇的兴趣之间没有差异。这些指标通过三箱社交测试（TCST）进行评估，自闭症相关的行为缺陷通过互惠社交互动测试（RSIT）评估，小鼠的学习和记忆力通过新物体识别（NOR）测试进行评估，这表明小鼠的一般社交能力和记忆力不受噬菌体影响（图4E）。值得注意的是， T7L组的大肠杆菌量在第8天下降到T7H组的水平，正是在这个时间点，T7L组开始表现出与T7H相似的行为异常。因此，两个实验组的结果同时表明，小鼠的行为障碍与大肠杆菌种群直接相关，而并非与整个肠道微生物群的级联效应相关。
图4. 大肠杆菌敲除小鼠表现出抗焦虑药治疗的行为模式。（E）三箱社交测试
5. 噬菌体处理小鼠的主要器官未发现病理异常
在解剖学上，各组小鼠小肠和大肠上皮表现出反应性增生，保留了正常的腺体结构和核极性（图4F），细胞显示出核质比轻度增加，细胞核略微增大，核深染和有丝分裂率增加，而不存在明显的多形性和非典型有丝分裂。此外，其他主要器官没有观察到异常，即脑、心、肺、肝、脾和肾的病理形态在所有组间没有差异，表明宿主的生理健康与行为改变可能无关。
图4. 大肠杆菌敲除小鼠表现出抗焦虑药治疗的行为模式。（F）各组小肠和大肠上皮细胞病理形态均表现为反应性增生，各组间保持正常腺体结构和核极性。
6. 行为恢复与大肠杆菌种群的恢复相关
大肠杆菌在第14天逐渐恢复到T7处理前水平的25%，进一步确定噬菌体干预后细菌是否可以完全恢复正常非常重要（图2C）。研究者使用qPCR实验对T7H组和对照组进行粪便大肠杆菌水平追踪实验。第16天的大肠杆菌水平约为对照组的30%，与上一次实验中第14天观察到的水平相似（图5A）。随着细菌水平继续恢复，在大约第24天恢复到噬菌体处理前的水平。为了确认行为异常是由于大肠杆菌敲除引起的，研究者还通过将大肠杆菌灌胃到T7处理的小鼠进行了挽救实验（图5B）。
研究者在第0天（基线）、第4天（T7H管饲后）和第8天（大肠杆菌管饲后）使用TST评估小鼠行为。qPCR结果显示，在14天的实验中，由于口服强饲噬菌体和大肠杆菌，大肠杆菌水平出现波动（图5B）。处理前、T7H处理后和大肠杆菌挽救实验后的TST结果反映符合粪便大肠杆菌的水平（图5C）。值得注意的是，第8天的结果表明，小鼠在重新引入大肠杆菌后恢复正常。
图5. 大肠杆菌自我恢复与挽救实验。(A）T7处理组肠道大肠杆菌水平在14天实验后逐渐恢复（数据从第16天开始），并在第24天恢复到噬菌体处理前水平。(B）T7处理组与对照组在14天挽救实验期间的肠道大肠杆菌水平，在第4天施用噬菌体，在第8天给予大肠杆菌灌胃（n = 12）。(C）第0，4和8天的TST结果显示小鼠的行为变化与大肠杆菌的敲除和重新引入之间的相关性。
实验结论
无菌和悉生小鼠模型已被广泛用于肠道微生物群研究，以证明某些细菌与人类疾病之间的直接联系。虽然这种方法为确定接种微生物在受控环境中的具体贡献提供了优势，但它没有考虑群落中的一般微生物群，特别是由于一种细菌变化而导致的物种代表的变化。以前使用悉生动物对大肠杆菌的研究表明了肠道防御能力的加强以及对精神的作用。此外，口服大肠杆菌已被证明会增加健康小鼠的焦虑样行为，并且大肠杆菌衍生的脂多糖（LPS）被证明在抗抑郁药样行为而非抗焦虑样行为中发挥重要作用。
本研究中的大肠杆菌敲除TBD模型证明了大肠杆菌在具有完整肠道微生物群的野生型小鼠中的神经学作用。这些小鼠表现出独特的“勇敢”行为特征，与先前发表的由联合抗焦虑药和/或抗抑郁药治疗引起的行为模式有一定程度的相似性。
通过检测大肠杆菌的量和细菌多样性随时间的变化，研究者得出结论，大肠杆菌丰度变化是导致观察到的行为变化的原因，研究者推测除了LPS之外，其他大肠杆菌衍生物也可能是引起这种行为变化的原因。能够随着时间的推移快速评估目标细菌和微生物群环境，比仅单独检测选定细菌的悉生模型具有明显优势。同时，大肠杆菌噬菌体作为单剂量提供抗抑郁或抗焦虑作用以治疗抑郁症或焦虑症的潜在应用应当在未来的研究中进一步研究。这种经济有效又省时的TBD模型将加速肠道细菌与健康之间新相互作用的建立
该研究获得国家科技部重点专项、国家自然科学基金、陕西省重点研发计划的资助，并获得了西安交通大学第一附属医院生物样本信息资源中心和脑科学研究中心的大力支持。
西安交通大学博士生李琰清，西安交通大学第一附属医院朱峰教授、李燕教授为文章共同第一作者，刘冰教授、马现仓教授、王亚文教授为文章共同通讯作者。